Перспективы применения плюрипотентных стволовых клеток человека в эндокринологии

Клетки, составляющие разнообразие тканей многоклеточного организма, от его зарождения (оплодотворенная яйцеклетка) до момента биологической смерти претерпевают несколько десятков делений. Некоторые из них, начиная с самых ранних этапов развития организма, приобретают черты терминальной дифференцировки и постепенно теряют потенциал к превращению в различные специализированные типы клеток. В норме это однонаправленный процесс: любая дифференцированная клетка не возвращается назад, не становится прогениторной или стволовой клеткой. Однонаправленность движения заложена в генетической программе, реализуемой в естественных условиях. Первая специализация клеток наступает на стадии бластоцисты, происходит деление на трофоэктодерму и внутреннюю клеточную массу. Клетки внутренней клеточной массы можно изъять из бластоцисты, и в специально подобранных условиях культивирования они способны длительное время пролиферировать in vitro, оставаясь при этом плюрипотентными, т.е. в условиях in vitro способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков [1, 2]. Такие клетки назвали эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). ЭСК человека были впервые получены в 1998 г. Томсоном и коллегами из избыточных бластоцист, невостребованных в процессе применения вторичных репродуктивных технологий [3].

Важным свойством ЭСК является то, что, несмотря на длительное существование в культуре in vitro, они могут полностью выполнить программу эмбрионального и онтогенетического развития при помещении их обратно в бластоцисту даже после генетических манипуляций с ними. За открытие принципов введения специфических генных модификаций в организм мышей посредством ЭСК, то есть за изобретение метода нокаута генов, в 2007 г. М. Эвансу, О. Смитису и М. Капеччи была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине.

Сегодня дифференцированные производные линии ЭСК человека активно используются для разработки биомедицинских клеточных продуктов. Так, в США и Великобритании с 2009 г. проводятся клинические исследования по терапии наследственной и возрастной макулодистрофии сетчатки глаза. По данным американских исследователей, более чем у половины пациентов появилось зрение [4, 5]. Та же линия ЭСК человека была использована другой компанией для получения инсулинпродуцирующих клеток (http://viacyte.com/). Полученные клетки были помещены в проницаемые контейнеры и имплантированы пациентам, страдающим сахарным диабетом. Завершение 1-й фазы клинических исследований ожидается в 2017 г. Три года клетки будут находиться под защитой мембраны, которая не допустит реакции отторжения со стороны клеток иммунной системы организма. С другой стороны, инсулин сможет свободно выходить из контейнера, а питательные вещества – проникать внутрь устройства [6].

В США и Европейском союзе уже одобрены клинические исследования по терапии болезни Паркинсона с помощью дофаминергических нейронов, полученных из тех же ЭСК человека (www.gforce-pd.com/). Несмотря на значительный терапевтический потенциал ЭСК человека и активное использование этого клеточного продукта во многих передовых странах мира, имеется ряд существенных ограничений. Во-первых, иммунологически ЭСК не родственны тканям пациентов. При проведении трансплантации в иммунопривилегированные ткани (мозг, глаз) возможно использование аллогенного материала, однако для большинства методов терапии необходимо использовать аутологичный, низкоиммуногенный клеточный продукт. Во-вторых, в России по непонятным причинам использовать ЭСК человека запрещено законодательством [7].

Развитие технологий полногеномного анализа позволило достаточно точно охарактеризовать транскрипционный профиль генов, экспрессирующихся в различных специализированных клетках, в том числе и в ЭСК. Целый ряд транскрипционных факторов оказался уникальным для плюрипотентного состояния, и, скорее всего, они определяли его. Экспериментально это было доказано Такахаши и Яманака, которые клонировали выбранные гены в ретровирусные векторы и инфицировали ими в различных комбинациях мышиные фибробласты. Были идентифицированы 4 гена транскрипционных факторов: Oct-4, Sox2, c-Myc и Klf4, которые переводят фибробласты в плюрипотентное состояние. Клетки, полученные таким образом, назвали индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК). Результаты этой работы были опубликованы в 2006 г. [8], экспериментальный подход поразил многих ученых, работающих в данной области, как совершенно неожиданный, хотя предпосылки к успеху были еще в 1987 г. – Дэвис и соавт. показали, что трансгенная экспрессия единственного транскрипционного фактора MyoD может превратить фибробласты в клетки мышц [9]. Получение ИПСК не требует разрушения эмбрионов, что снимает этические проблемы, связанные с применением таких ПСК в научных исследованиях и в будущем в регенеративной медицине. Уже через год после оригинальной публикации, в 2007 г., Яманака успешно получил ИПСК из фибробластов человека с использованием того же набора транскрипционных факторов Oct4, Sox2, c-Myc и Klf4 [10]. Независимой группой Джеймса Томсона в этом же году были получены ИПСК человека с использованием иного набора транскрипционных факторов: Oct4, Sox2, Nanog и Lin28 [11]. Дальнейшие исследования продемонстрировали возможность получения ИПСК как от различных млекопитающих: крыс [12], макак-резусов [13], свиней [14], так и из различных типов соматических клеток: кератиноцитов [15], нейрональных клеток [16], клеток печени и клеток желудка [17], терминально дифференцированных лимфоцитов [18]. В Российской Федерации нами были впервые получены ИПСК из эндотелия пупочной вены человека – материала, который доступен в неограниченном количестве, может храниться длительное время и прежде не подвергался воздействию внешней среды, в отличие, например, от фибробластов кожи [19]. Эти исследования продемонстрировали универсальность процесса репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния с помощью введения в клетки генов транскрипционных факторов.

Целый ряд подходов был разработан для того, чтобы доставлять репрограммирующие факторы в соматические клетки. В первых работах по изучению и характеристике ИПСК использовались преимущественно ретровирусные векторы [20], которые встраиваются в геном клетки-хозяина. Было показано, что ретровирусные трансгены перестают экспрессироваться к концу репрограммирования [21], это явление назвали замолканием трансгена, или сайленсингом. Группе Яманака впервые удалось репрограммировать соматические клетки до плюрипотентного состояния с помощью плазмид, не встраивающихся в геном клетки-хозяина, однако эффективность такого репрограммирования оказалась крайне низкой [22]. Были также продемонстрированы и другие методы репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния без встраивания экзогенной ДНК в геном клетки-хозяина: с использованием piggyBac транспозона [23], синтетической РНК [24], аденовирусных векторов [25], вируса Сендай [26], эписомных векторов [27], белков [28]. Так как репрограммирование – это, в общем, низкоэффективный процесс, были проведены работы по поиску способов повышения эффективности репрограммирования. Были идентифицированы химические молекулы, которые повышают эффективность репрограммирования [29–31]. Эти молекулы, как правило, оказывают влияние на эпигенетическую машину клетки и/или способны выполнять функцию некоторых репрограммирующих факторов.

Поскольку источником для ИПСК при репрограммировании являются соматические клетки, эти клетки ранее в процессе эмбрионального развития и дифференцировки претерпели ряд значительных эпигенетических изменений. Поэтому эквивалентность получаемых ИПСК и ЭСК – это сложный и не разрешенный на сегодняшний день вопрос. Генетические и эпигенетические отличия между ЭСК и ИПСК могут влиять на процесс дифференцировки, что может привести при дифференцировке к появлению клеток с профилями экспрессии генов и биологическими характеристиками, отличными от клеток, полученных из ЭСК. Методом инъекции диплоидных ИПСК в тетраплоидную бластоцисту (тетраплоидная комплементация) была выращена мышь, организм которой полностью развился из ИПСК, что указывает на эквивалентность некоторых линий ИПСК по своей способности к дифференцировке эмбриональным стволовым клеткам [32]. В случае клеток человека аналогичное клонирование с использованием как ЭСК, так и иПСК невозможно ни этически, ни законодательно, поэтому исследователям доступны только менее строгие тесты, такие как in vitro дифференцировки, формирование тератом при введении иммунодефицитным мышам и способность к образованию эмбриоидных телец.

Для более точного отбора линий ИПСК, соответствующих ранее существовавшим ЭСК, нами была определена панель из 280 генов, экспрессия которых позволяет минимум из 5 независимо отобранных клонов выбрать наиболее «совершенную» линию [33]. Помимо существенного изменения транскрипционного паттерна, репрограммирование сопровождается глобальными изменениями на уровне эпигенома, гистонового кода и метилирования ДНК. Как было показано нами ранее, репрограммирование «стирает» метилирование ДНК, соответствующее соматическому типу клеток, и устанавливает новый паттерн, эквивалентный плюрипотентному состоянию [34]. Самым замечательным является тот факт, что способ репрограммирования (вирусное интеграционное, эписомное, неинтеграционное, с помощью РНК) не оказывает значимого влияния на транскриптом и эпигеном репрограммированных клеток, свидетельствуя о том, что для получения терапевтически пригодных линий возможно использование любого подхода.

Технология репрограммирования впервые была представлена научному сообществу в 2006 г. [8], в 2012 г. ее автор профессор Яманака был удостоен Нобелевской премии, а в 2014 г. в Японии уже были начаты клинические испытания пигментного эпителия сетчатки глаза, полученного из персональных ИПСК пациентки для терапии возрастной макулодистрофии [35]. Такой интерес к терапии болезней зрения с помощью клеточных технологий связан в первую очередь с тем, что сегодняшние технологии диагностики и мониторинга зрения позволяют заглянуть вглубь глаза неинвазивными методами. Можно хоть каждый день вести наблюдения за трансплантированными клетками, не причиняя никакого неудобства пациенту. В 2015 г. по ряду причин клинические исследования были приостановлены и продолжились в марте 2017 г., но уже с использованием неродственных ИПСК, гомозиготных по главному комплексу гистосовместимости первого типа [36]. Это связано с тем, что даже в такой высокоразвитой стране как Япония в большинстве случаев персонализированный подход или не совсем оправдан по затратам времени, или очень дорог. Создание банка ИПСК, полученных от доноров, гомозиготных по наиболее частым локусам HLA-A, -B, позволит использовать эти линии как универсальные. По подсчетам, для удовлетворения 70% населения Японии требуется создать коллекцию, содержащую всего 50–70 линий определенного иммуногенотипа, однако в случае европейской популяции эти цифры сильно отличаются. Около 150 линий ИПСК смогут быть совместимы примерно с 50% европейской популяции [37].

Потенциал технологии репрограммирования еще заключается в возможности создания модельных систем для изучения патологий и разработки новых лекарственных средств. Большинство заболеваний манифестируют, когда патологический процесс зашел уже достаточно далеко, произошла деструкция ткани или потеря функции органом, и получить материал для изучения начальных стадий процесса не представляется возможным. Ярким примером являются нейродегенеративные заболевания. Даже в случае известной генетической причины получить для прижизненного изучения ткань человека не представляется возможным, а постмортальный материал уже не отражает черты собственно патологии, а скорее, результат ее длительного влияния на организм. Технология репрограммирования позволяет из небольшого числа клеток пациента (фибробласты кожи, кровь и др.) получить ИПСК и с помощью дифференцировки направить их в желаемый тип нейронов, который в условиях in vitro будет проявлять черты патологии. Недавно нами было проведено исследование хореи Гентингтона с использованием технологии репрограммирования. Хорея Гентингтона – это моногенное аутосомно-доминантное заболевание, которое возникает при повышенной экспансии тринуклеотидного повтора CAG, кодирующего аминокислоту глутамин, в гене Хантингтона HTT [38]. Появление в гене HTT больше 36 повторов сопровождается гибелью серединных шипиковых нейронов полосатого тела в возрасте 35–45 лет. Наиболее часто встречающийся патологический генотип имеет 40–50 повторов, модельные системы на животных проявляют патологию при количестве повторов, приближающемся к 100. Сегодня не существует терапевтических средств для лечения патологии, после манифестации заболевания смерть наступает в течение 5–10 лет в зависимости от количества полиглутаминовых повторов [39]. Для изучения патологии нами были получены линии ИПСК от пациентов, имеющих чуть более 40 повторов, и линии ИПСК от здоровых доноров. Сравнение характеристик ИПСК не выявило значительной разницы в характеристике клеток, однако в дифференцированных нейронах удалось обнаружить некоторые особенности, которые раньше были обнаружены или в постмортальном материале, или на модельных организмах. В нейронах, которые были дифференцированы in vitro на протяжении 2–6 месяцев, мы обнаружили нарушения в аутофагии, функции митохондрий, структуре клеточного ядра [40]. Более того, изучение депо-управляемого кальция показало значительное (примерно в 2 раза) изменение входа кальция в патологических нейронах. Удивительно, что это стабильно наблюдалось на всех культурах нейронов, полученных от разных линий ИПСК доноров биологического материала. Это говорит о высокой воспроизводимости модельной системы и возможности ее использования в скрининговых целях. Однако в изученных нами временных точках от начала дифференцировки мы не наблюдали разницы в выживаемости контрольных и мутантных нейронов. Т.е. несмотря на наличие мутантного фенотипа (избыток лизосом, митохондрии и ядра неправильной формы, вход кальция), эти нарушения не сказывались на жизнедеятельности нейронов. На уровне организма манифестация заболевания происходит с возрастом, когда начинается активное старение организма. Обычно старение организма сопряжено с ингибированием протеасомной системы. Использовав подход протеасомного ингибирования in vitro, мы добились преждевременного старения клеток, которое сопровождалось гибелью нейронов. А в этом случае мутантный генотип приводил к тому, что патологические нейроны погибали примерно вдвое быстрее, чем нормальные. Разработанная модельная система позволила нам предложить генный препарат. В результате данная молекула не только устраняла такие черты патологии, как нарушение аутофагии, структура ядра и митохондрий, но и предотвращала гибель нейронов, а потому может стать перспективной основой для разработки препарата для лечения хореи Гентингтона.

Причиной возникновения диабета 1 типа в подавляющем числе случаев является аутоиммунная реакция, вызывающая гибель β-клеток, и лишь небольшая доля (5-7%) случаев развития патогенеза связана с другими механизмами. Лидирующее положение среди редких вариантов диабета 1 типа занимают моногенные формы, ассоциированные с мутациями в генах, обеспечивающих нормальное развитие и функцию β-клеток поджелудочной железы. Прогресс в области геномных исследований позволил определить целый ряд генов, таких как HNF1A, GCK, HNF4A, PAX4 и другие, которые приводят к проявлению заболевания. Помочь таким пациентам избежать ежедневных инсулиновых инъекций можно, сделав им пересадку β-клеток поджелудочной железы, вырабатывающих инсулин. Но такие клетки получают из трупного материала, их количество невелико, а качество не всегда соответствует требованиям. Кроме того, пациентам с трансплантированными чужеродными β-клетками приходится постоянно принимать лекарства, угнетающие иммунную систему и подавляющие иммунный ответ на трансплантат. Лекарства же эти далеко не безопасны и могут, например, провоцировать развитие почечной недостаточности. Решение проблемы в случае моногенных форм диабета может лежать в области репрограммирования соматических клеток пациента, проведения геномного редактирования мутации и дифференцировки ИПСК в инсулинпродуцирующие клетки для трансплантации. Технология геномного редактирования уже проходит стадию клинических исследований [41] и, несомненно, в ближайшие несколько лет будет транслирована в практическую медицину. За последние несколько лет были разработаны несколько эффективных протоколов, позволяющих направить специализацию ИПСК человека в β-клетки, секретирующие инсулин, и даже начать клинические исследования [42–45]. Комбинация двух технологий может дать персональный клеточный продукт для пациентов, неизлечимо больных диабетом.

Отдельную группу составляют пациенты, у которых возникла аутоиммунная реакция на инсулинпродуцирующие клетки. В этом случае трансплантация инсулинпродуцирующих клеток приведет к их распознаванию со стороны иммунной системы организма и уничтожению. Для предотвращения этого необходимо убрать с поверхности трансплантируемых клеток HLA-A, -B, которые представляют антигенные пептиды, распознающиеся Т-клеточным рецептором цитотоксических лимфоцитов. Именно это приводит к активации Т-клеток и проявлению их цитотоксичности в отношении инсулинпродуцирующих клеток. Снижение экспрессии HLA-A, -B может в значительной мере снизить цитотоксическое действие аутореактивных лимфоцитов. Этого можно достичь за счет проведения генетического нокаута гена 2-микроглобулина, который участвует в презентации комплекса гистосовместимости [46]. Полученная линия ИПСК со сниженной иммуногенностью будет «незаметна» не только для клеток иммунной системы, нацеленных на специфические маркеры бета-клеток, но и для распознавания системой свой-чужой. Таким образом, возможно создание универсального клеточного продукта, который будет совместим с большим числом реципиентов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, о которых необходимо сообщить.

Участие авторов. А.В. Панова и С.Л. Киселев – написание рабочей версии статьи; А.В. Панова и Д.В. Голиусова – редактирование материалов и представление в редакцию.