Персонализация коррекции нарушений углеводного обмена с учетом генотипа у пациентов с сахарным диабетом типа MODY, обусловленного мутациями в генах GCK, HNF1A, HNF4A

АКТУАЛЬНОСТЬ

Расшифровка персонального генома в 2007 г. положила начало эре персонализированной медицины. В результате двух научных прорывов – геномного и постгеномного – сначала была определена полная последовательность генома человека, а потом описаны генные варианты, различающиеся по своей частоте у народов мира. Развитие методов секвенирования нового поколения (Next Generation Sequencing – NGS) и других постгеномных технологий, в том числе полногеномного исследования ассоциаций (GWAS), позволило выявить редкие генные варианты, вносящие значительный вклад в развитие многих хронических заболеваний человека [1–3].

Персонализация терапии сахарного диабета, наряду с персонализацией других хронических заболеваний, с каждым годом приобретает все большее значение не только в связи с достижениями фармакологии, но и с учетом расширения представления о этиопатогенезе заболевания [4]. Создание таргетных фармакологических препаратов базируется, в том числе, и на результатах генетических исследований. Несмотря на то что у большинства пациентов с сахарным диабетом диагностируется диабет 1 и 2 типов, 5–10% всех случаев заболевания имеют моногенную природу [5].

Сахарный диабет типа MODY (Maturity-Onset Diabetes of the Young, «диабет взрослого типа у молодых») – гетерогенная аутосомно-доминантно наследуемая группа заболеваний, обусловленная мутациями генов, приводящими к дисфункции β-клеток поджелудочной железы (ПЖ). Впервые термин «Maturity-Onset Diabetes of the Young» и аббревиатуру «MODY» ввели Tattersall и Fajans в 1975 г для определения наследственного непрогрессирующего или малопрогрессирующего инсулиннезависимого СД у молодых лиц [6, 7]. Первый ген-кандидат MODY (GCK) верифицирован в 1992 г. Floguel и соавт. [8]. На текущий момент известно 13 генов-кандидатов MODY (HNF4A, GCK, HNF1A, PDX1, HNF1B, NEUROD1, KLF11, CEL, PAX4, INS, BLK, ABCC8, KCNJ11) и, соответственно, 13 подтипов MODY. Молекулярно-генетическое подтверждение варианта MODY диабета имеет принципиальное значение для выбора тактики лечения. Так, в случае с MODY2 компенсация углеводных нарушений может быть достигнута на фоне диетотерапии, в случае с MODY 1 и 3 эффективен прием пероральных сахароснижающих препаратов (ПССП), а при мутациях в других генах-кандидатах может потребоваться назначение инсулинотерапии (ИТ).

Цель настоящей публикации – расширить представления о моногенных формах сахарного диабета и продемонстрировать принципы персонализированной терапии на примере наиболее распространенных типов сахарного диабета типа MODY.

МЕТОДЫ

Молекулярно-генетическое исследование (МГИ) проведено 312 пациентам в возрасте от 3 месяцев до 25 лет (162 мальчика, 150 девочек) и 93 родственникам обследованных детей. Медиана возраста пациентов на момент проведения исследования составила 10,9 лет. Критерии включения: нарушения углеводного обмена (НУО) различной степени выраженности, отрицательный титр аутоантител к ICA, GAD, IA2, IAA, сохранная секреция эндогенного инсулина. МГИ проведено с помощью технологии NGS.

Молекулярно-генетический анализ проведен в лаборатории отделения наследственных эндокринопатий ФГБУ ЭНЦ Минздрава России. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферический крови стандартным методом (PureLink, Genomic DNA MiniKit, LifeTechnologies, США). Анализ выполнен методом высокопроизводительного параллельного секвенирования. Использовалась разработанная в отделении наследственных эндокринопатий ЭНЦ панель праймеров для мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования с применением технологии Ion Ampliseq Custom DNA Panel (LifeTechnologies, США). Авторская панель «Сахарный диабет» включала 28 генов: HNF4A, GCK, HNF1A, PDX1, HNF1B, NEUROD1, KLF11, CEL, PAX4, INS, BLK, ABCC8, KCNJ11, AKT2, EIF2AK3, FOXP3, GCG, GCGR, GLIS3, GLUD1, INSR, PPARG, PTF1A, RFX6, SCHAD, SLC16A1, WFS1, ZFP57 (488 ампликонов). Подготовка библиотек и эмульсионная ПЦР проводились в соответствии с рекомендациями производителя. Секвенирование осуществлялось на полупроводниковом секвенаторе PGM (Ion Torrent, LifeTechnologies, США). Биоинформатическая обработка результатов секвенирования проводилась с помощью программного модуля TorrentSuite 4.2.1 (IonTorrent, LifeTechnologies, США) и пакета программ Annovar (версия 2014Nov12) (http://www.openbioinformatics. org/annovar). После анализа полученных данных мутации подтверждались на секвенаторе Genetic Analyzer Model 3130 (LifeTechnologies, США). В качестве референсных последовательностей генов использовались ссылки Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Не описанные ранее несинонимичные мутации считались «возможно патогенными» при частоте минорного аллеля менее 0,1% и оценке их как «патогенные» по программе Annovar. Обозначение мутаций проводилось в соответствии с рекомендациями J. Den Dunnen и S. Antonarakis.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мутации в генах-кандидатах MODY выявлены у 178 (57,1%) пробандов. Гетерозиготные мутации в генах GCK (MODY2), HNF1A (MODY3), HNF4A (MODY1), обуславливающие развитие наиболее часто встречающихся среди неиммунных форм диабета типов MODY, значительно превалировали в нашем исследовании (табл. 1).

Таблица 1. Спектр выявленных мутаций в генах HNF4A, GCK, HNF1A

n – количество пробандов с мутацией, Н – новая мутация, О – ранее описанная мутация

Распространенность наиболее частых форм MODY, обусловленных мутациями в генах GCK, HNF1A, HNF4A

В гене GCK (MODY2) было выявлено 99 мутаций у 129 пробандов (61,1%), 10 сибсов, 57 родителей, 7 человек 2-й степени родства, 2 человек 3-й степени родства, 1 человека 4-й степени родства; в HNF1A (MODY3) – 20 мутаций у 19 (9,0%) пробандов, 10 родителей, 3 человек 3-й степени родства, 1 человека 4-й степени родства; в HNF4A (MODY1) – 8 мутаций у 9 (4,3%) пробандов, 1 сибса, 2 родителей. Все мутации найдены в гетерозиготном положении.

В гене GCK выявлено 37 новых мутаций, 6 из которых выявлены у неродственных пробандов, 62 – ранее описанных. Из ранее описанных мутаций чаще встречались миссенс-мутации p.F150Y, p.C213R (n=5), p.E256K, p.G258C (n=4), p.R191W, p.Y273N (n=3) и p.L20R, p.G80S, p.E157K, p.L185V, p.R186L, p.C382R (n=2). У одного пациента выявлены две мутации в гене GCK – новая (p.E265D) и ранее описанная (p.C213R). Преобладали миссенс-мутации (n=80, 80,8%); также найдены делеции со сдвигом (n=4) и без сдвига рамки считывания (n=3), мутации сайта сплайсинга (n=5), нонсенс-мутации (n=4), инсерции без сдвига рамки считывания (n=2) и одна мутация с изменением стоп-кодона (p.X446S). Наиболее часто мутации были локализованы в экзонах 7 (n=18), 9 (n=13), 5 (n=13), 2 (n=11), 4 (n=11) и 8 (n=9). В экзонах 1, 11 и 12 мутации не обнаружены.

В гене HNF1A (MODY3) обнаружено 20 мутаций у 19 (9,0%) пробандов. В 1 случае пробанд, родитель и 4 родственника имели 2 мутации в гене HNF1A. Из выявленных мутаций 3 ранее не описаны: 2 миссенс-мутации (c.508C>Gp.Q170E, c.1813A>C p.N605H) и 1 дупликация со сдвигом рамки считывания (c.1012dupGp.G339RfsX80). Наиболее часто мутации располагались в экзоне 4 (n=6). Мутации в экзонах 7, 8 и 9 не обнаружены.

В гене HNF4A (MODY1) выявлено 8 мутаций у 9 (4,3%) пробандов: 1 новая мутация сайта сплайсинга (c.50-3delC) и 7 ранее описанных мутаций. Мутация c.439G>A p.V147I выявлена у двух неродственных пробандов и одного родителя, имеющего НУО. Мутация, затрагивающая 5’-нетранслируемую область, помимо пробанда, выявлена у сибса и родителя, также имеющих НУО. Наиболее часто мутации обнаружены в экзоне 1 (n=3), а в экзонах 3 и с 6 по 12 мутации не обнаружены.

Клиническая характеристика вариантов MODY, обусловленных мутациями в генах GCK, HNF1A, HNF4A, и модификация терапии

Мутации в гене GCK (MODY2) в нашем исследовании достоверно превалируют. MODY2 обусловлен гетерозиготными мутациями в гене глюкокиназы GCK. Ген глюкокиназы (GCK) картирован на хромосоме 7p13, имеет 12 кодирующих экзонов и кодирующую последовательность 1398 пар нуклеотидов. К настоящему времени в мире выявлено более 600 мутаций в гене GCK (http://www.hgmd.cf.ac.uk/). MODY 2 – один из самых частых вариантов MODY (40–60%) в европейской популяции [9, 10]. Вследствие мутаций нарушается способность глюкокиназы фосфорилировать глюкозу, и, как следствие, увеличивается минимальная концентрация глюкозы, необходимая для стимуляции выброса инсулина [10]. В силу своей широкой распространенности и наиболее четкой среди всех MODY корреляции «фенотип-генотип» клиническая картина MODY2 изучена и описана достаточно хорошо. Клинически MODY 2 может протекать в виде пограничной непрогрессирующей гипергликемии натощак и, реже, в виде нарушений толерантности к углеводам. Как правило, повышение гликемии натощак в пределах 5,5–8 ммоль/л выявляется у детей и молодых взрослых, носит бессимптомный характер, не прогрессирует в течение длительного времени, не приводит к сосудистым осложнениям и не требует медикаментозной коррекции [12]. Данный тип диабета MODY может быть успешно компенсирован на фоне диетотерапии.

На момент выявления НУО все пациенты с MODY2 имели повышенный уровень гликемии натощак (5,7–9,2 ммоль/л), однако в ходе перорального глюкозотолерантного теста (ПГТТ) (венозная плазма) у 32 (24,8%) пациентов базальный уровень гликемии был ниже 6,1 ммоль/л. Данный уровень гликемии во многом зависел от потребления пациентами углеводов, которое было ими значительно сокращено после выявления НУО. В ходе ПГТТ в 29 (22,5%) случаях уровень гликемии через 2 ч был в пределах нормы, в 4 (3,1%) случаях достигал диабетического уровня (11,9–13,5 ммоль/л), а в подавляющем количестве (n=96, 74,4%) диагностирована НТГ. Таким образом, патогномоничные для MODY2 умеренная гипергликемия натощак и НТГ и в нашем исследовании были основными типами НУО у пациентов с MODY2. Ни у одного пациента в дебюте не отмечался кетоацидоз. На момент включения в исследование ИТ в среднесуточной дозе 0,2 ед/кг/сут (0,07; 0,4) получали 10 детей (7,7%), метформин (МФ) в дозе 500–2000 мг/сут – 13 пациентов (10,1%), остальные пациенты (82,2%) придерживались диеты. Стоит отметить, что МФ был рекомендован в основном группе пациентов, имевших избыточную массу тела и ожирение на момент выявления НУО. После молекулярно-генетического подтверждения диагноза MODY2 всем детям было рекомендовано соблюдение диеты с исключением легкоусвояемых углеводов с положительным клиническим эффектом и отсутствием ухудшений показателей НbА1с в динамике (табл. 2).

Таблица 2. Модификация терапии у пациентов с MODY2 после молекулярно-генетического подтверждения диагноза

Сахарный диабет типа MODY3 обусловлен мутациями в гене ядерного фактора гепатоцитов 1 альфа (HNF1А), приводящими к дефекту в метаболизме инсулиновой секреции и/или снижению количества β-клеток ПЖ [13]. Ген HNF1A картирован на длинном плече 12 хромосомы, имеет 10 кодирующих экзонов и кодирующую последовательность 1893 пар нуклеотидов [14, 15]. Состоящий из 631 аминокислотных остатков регуляторный белок выступает в качестве гомеодомен-содержащего фактора транскрипции и экспрессируется в панкреатических β-клетках, печени, кишечнике, почках [16]. Свыше 400 различных мутаций в гене HNF1A обнаружено как в кодирующей последовательности, так и в промоторе [17], более 50% из которых приходится на долю миссенс-мутаций.

Нарушения углеводного обмена в случае MODY3 варьируют в широком диапазоне: от гипергликемии натощак до манифестного диабета. Если для MODY2 характерна гипергликемия натощак в пределах 5,6–8,3 ммоль/л, то при MODY3 уровень гликемии натощак может достигать диабетических значений, что ярко продемонстрировано и в нашем исследовании. Важно отметить, что нормальный базальный уровень гликемии не является достаточным диагностическим критерием исключения MODY3, и обязательным является проведение ПГТТ при подозрении на данную форму диабета. Поскольку HNF1A экспрессируется и в почках, характерно снижение почечного порога для глюкозы, которое зачастую проявляет себя бессимптомной глюкозурией (ГУ). Данный симптом обусловлен дефектом натрийзависимого переносчика глюкозы SGLT2 (белок HNF1A контролирует транскрипцию гена SGLT2) [18]. У 11 (57,9%) наших пациентов с MODY3 данный симптом в анамнезе присутствовал, у 6 на фоне нормогликемии. В этой связи важно еще раз подчеркнуть, что именно сочетание ГУ с нормогликемией или пограничной гликемией натощак (ПГН) у пациентов без заболеваний почек должно стать причиной обращения к эндокринологу и началом диагностического поиска. Вид терапии данного типа MODY в настоящее время не вызывает сомнений. Несмотря на то что пациенты с мутациями в гене HNF1A, по сравнению с другими типами MODY, наиболее чувствительны к гипогликемическому эффекту препаратов сульфонилмочевины (СМ) [19], по мере снижения инсулиновой секреции вероятно назначение ИТ.

Медиана уровня гликемии при манифестации среди пациентов с MODY3 c клинической картиной диабета (n=4) составила 19,5 ммоль/л (10; 3 ммоль/л), HbA1c – 10,5% (7,7; 12,4%). Среди пациентов, у которых диабет диагностирован случайно, медиана уровня гликемии составила 10,7 ммоль/л (4,1; 18,5 ммоль/л), HbA1c – 7,0% (5,1; 10,4%). На момент проведения МГИ ИТ получали 9 пациентов в дозе 0,48 ед/кг/сут (0,2; 1,2), МФ в дозе 500–1500 мг/сут 5 пациентов, без терапии находились 5 пациентов.

После молекулярно-генетического подтверждения диагноза 7 пациентов, получавших ИТ, и 5 пациентов, получавших МФ, были успешно переведены на патогенетическую терапию препаратами из группы СМ: 4 на глибенкламид в дозе 5,25–7,5 мг/сут, 8 – на гликлазид в дозе 30-60 мг/сут. ИТ продолжена у 2 пациентов с ранней диагностикой диабета в связи с высокой потребностью в инсулине (1,1–1,2 ЕД/кг/сут) и низким уровнем эндогенного инсулина (табл. 3).

Таблица 3. Модификация терапии у пациентов с MODY3 после молекулярно-генетического подтверждения диагноза

Сахарный диабет MODY1 обусловлен гетерозиготными мутациями в гене ядерного фактора гепатоцитов 4 альфа (HNF4A). Ген HNF4A локализован на хромосоме 20q13.12, состоит из 13 экзонов (экзоны 2-10 и экзоны альтернативного сплайсинга 1A 1B 1C и 1D) и кодирующей последовательности 465 пар нуклеотидов. HNF4A играет ключевую роль в развитии и дифференцировке, а также дальнейшем поддержании функционирования β-клеток поджелудочной железы и печени [20]. Распространенность данного подтипа составляет около 10% среди всех вариантов MODY. К настоящему времени описано более 100 мутаций в гене HNF4A в 173 семьях [17], среди которых превалируют миссенс- и нонсенс-мутации (n=52). Данный подтип характеризуется выраженной вариабельностью клинических проявлений – от асимптоматических нарушений до тяжелого диабета с развитием кетоза. Часто НУО выявляются на фоне ожирения. Как и в случае с MODY3, гипергликемия и снижение секреции инсулина у больных с MODY1 прогрессируют с течением времени, что приводит к необходимости лечения ПССП или инсулином (у 30–40% пациентов). Пациенты с MODY1 или MODY3 могут иметь полный спектр сосудистых осложнений сахарного диабета, особенно ретино- и нефропатии. Как при 1-м и 2-м типе диабета, микрососудистые осложнения у пациентов с MODY1 определяются степенью гликемического контроля [21]. Так, в нашем исследовании 1 пациент с MODY1 со стажем 7,9 лет имел диабетическую полинейропатию уже через 3 года после выявления НУО.

В гене HNF4A (MODY1) выявлено 8 мутаций у 9 (4,3%) пробандов: 1 новая мутация сайта сплайсинга (c.50-3delC) и 7 ранее описанных мутаций (см. табл. 1). Мутация c.439G>A p.V147I выявлена у двух неродственных пробандов и одного родителя, имеющего НУО. Мутация, затрагивающая 5’-нетранслируемую область, помимо пробанда, выявлена у сибса и родителя, также имеющих НУО. Наиболее часто мутации обнаружены в экзоне 1 (n=3), а в экзонах 3 и с 6-й по 12-ю мутации не обнаружены.

Подтверждение диагноза MODY1 c помощью МГИ позволило модифицировать схему лечения пациента с мутацией p.E13GfsX92, у которого еще до молекулярно-генетического подтверждения диагноза в связи с частыми эпизодами гипогликемии ИТ по интенсифицированной схеме (1 ед/кг/сут) была заменена на комбинированную терапию инсулином продленного действия Лантус (0,07 ед/кг/сут) и ПССП (Репаглинид 1,5 мг/сут), однако положительный эффект не был достигнут. Молекулярно-генетическое подтверждение MODY1 позволило полностью отменить ИТ, а на фоне Репаглинида в прежней дозе гипогликемии отсутствовали, и гликемия колебалась в пределах 4,4–5,9 ммоль/л.

Попытка перевода пациента с мутацией p.R112Q сИТ по интенсифицированной схеме (0,22 ед/кг/сут) на ПССП оказалась безуспешной (колебания гликемии на ИТ – 5,6–12 ммоль/л, на ПССП – 6,4–17 ммоль/л).

Оба пациента с мутацией p.V147I в терапии не нуждались (гликемия одного пациента на фоне диеты 4,0–6,6 ммоль/л, другого – 5,3–9,1 ммоль/л). Также в терапии не нуждался пациент с мутацией p.D43G (гликемия в пределах 5,2–9,3 ммоль/л).

Пациент с мутацией, затрагивающей 5’-нетранслируемую область, а также пациенты с мутациями p.N5AfsX50, c.50–3delC, p.R67W приглашены на повторную госпитализацию с целью рассмотрения вопроса о модификации терапии с учетом диагноза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Своевременное установление правильного диагноза является ключом к назначению адекватной терапии, оценке прогноза заболевания, проведению медико-генетического консультирования семьи. Генетический скрининг должен войти в рутинный алгоритм обследования при подозрении на наследуемый характер диабета, а генотип пациента, уточненный в ходе МГИ, должен быть положен в основу персонализированной терапии.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Работа выполнена при содействии Фонда поддержки и развития филантропии «КАФ».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования, сбор материала, анализ полученных данных, написание текста – Н.А. Зубкова, О.А. Гиоева, А.Н. Тюльпаков; сбор материала, анализ полученных данных – Н.А. Зубкова, Ю.В. Тихонович, О.А. Гиоева; проведение молекулярно-генетического исследования – В.М. Петров, Е.В. Васильев, А.Н. Тюльпаков.